眼科成像技术是诊断视网膜病变、疾病管理和衡量手术结果的基础。在过去几十年间，光学相干断层扫面（OCT），扫描激光检眼镜（SLO）以及自体荧光成像（FAF）等成像技术极大地促进了眼科领域的发展。然而，这些成像技术都是基于单光子荧光，难以识别和探测人类视觉循环过程中的维生素A类代谢物，无创评估人类视网膜视觉色素再生的代谢过程对于视网膜疾病的诊断与治疗至关重要。
典型的维生素A类衍生物如视黄醇和视黄醇酯，二者的最大吸收峰分别位于325 nm和326 nm，可以利用近红外波长的双光子荧光显微镜观察识别。本文提出了一种紧凑的双光子激发荧光扫描激光检眼镜（TPEF-SLO），装置图如图1所示：1560 nm飞秒光纤激光经二倍频后输出中心波长为780 nm的70 fs脉冲，依次通过预色散补偿、二维振镜、扩束系统后由晶状体聚焦到视网膜上。在视网膜上，一部分780 nm光激发双光子荧光并由PMT接收形成形成TPEF图像，还有一部分光经过视网膜反射原路返回，经过小孔后由APD接收形成反射率图像[1]。
本文系统有两大显著优势，一是能够利用反射率图像在成像期间对双光子荧光图像帧对准，减少运动伪影，以提高TPEF图像的信噪比；二是能够以相对较低的平均功率（0.3 mW，该数值远低于往前工作，具体可见图1D），及可宽泛调节的重频(1-12 MHz,本文固定6 MHz重频成像)，对活体人眼视网膜区域成像。
图1 由飞秒光纤激光器驱动的双光子激发荧光扫描激光检眼镜（TPEF-SLO）[1]
图2是利用本文系统对健康受试者眼底的两个区域成像，其中图2C是利用波长823 nm、平均功率0.3 mW的连续激光对受试者眼底成像，图2I和图2J分别为B-FAF(Blue-FAF)和NIR-FAF图像。比较图2A和图2C，在相同平均功率的条件下，飞秒激光激发能产生显著荧光信号，而CW激光几乎不产生荧光，这也是验证了本文成像结果确实是双光子荧光成像机制而非单光子荧光成像机制。
比较图2B、图2I和图2J，其中B-FAF图像在ROI 2处有一块黑色阴影，这是因为B-FAF的成像波长488 nm恰好位于黄斑色素吸收峰附近，而利用近红外波长可轻松绕过黄斑色素的吸收。图2H的荧光曲线也可说明这一点，B-FAF在偏心度为0°处荧光强度骤降，而TPEF和NIR-FAF的荧光曲线则没有这样的变化。
图2 基于TPEF-SLO系统对健康受试者眼底成像[1]
TPEF图像包含多个参与视觉循环内源性荧光团的贡献，为了进一步分析与比较这些荧光团的差异，本文在5个不同的光谱窗口（400-600 nm、594-646 nm、500-540 nm、400-550 nm和400-700 nm）中成像，并比较了人类模型中获得的结果与在动物模型中获得的测量结果。成像结果如图3所示，其中人眼底780 nm的TPEF发射光谱与Abca4+Rdh8+小鼠最相似。
图3 比较人眼底TPEF与多个小鼠模型的光谱特性[1]
TPEF技术要真正应用于临床，需要确保该技术对人眼无害，因此作者从结构（B-FAF、NIR-FAF和OCT）以及功能（单光子和双光子视野测量）上对TPEF成像的安全性评估。本文的TPEF-SLO系统中测试了一名44岁的受试者暴露于激光 2周前和4周后的眼睛，并对视网膜的2个位置采集TPEF图像。实验结果如图4所示，TPEF提供了安全的眼底成像，成像后没有任何结构或功能的改变。
图4 TPEF-SLO系统成像安全性验证 [1]
总之，本文基于TPEF无创光学成像技术，搭建了双通道TPEF-SLO成像系统，可以无创代谢评估人类视网膜。这种方法为在视网膜结构损伤发生之前的早期阶段监测眼病提供了可能性。
参考文献：
[1] Boguslawski, Jakub, et al. “In vivo imaging of the human eye using a 2-photon-excited fluorescence scanning laser ophthalmoscope.” The Journal of clinical investigation 132.2 (2022).